O genoma humano é como uma grande bola de fios, composta por 3 bilhões de unidades moleculares dispostas em sequência e depois enrolada em volta de si mesma. Dentro dessa bola de fios estão seus genes, que são regiões de DNA que são copiadas e depois transformadas em máquinas moleculares em miniatura chamadas proteínas. A estrutura tridimensional dos fios determina quais dos seus genes se transformam em proteínas e, quando esse sistema falha, a doença se desenvolve. Mas até agora, não era possível visualizar como as diferentes regiões do DNA conversam entre si no espaço e no tempo.
Uma equipe em Stanford liderada por Stanley Qiprofessor associado de bioengenharia nas escolas de Engenharia e Medicamento e Scholar do Instituto em Chem-H Saravane Em MoernerHarry S. Mosher Professor de Química no Escola de Humanidades e Ciênciascombinou sua experiência em tecnologia de DNA e imagens de super-resolução para desenvolver uma nova ferramenta que possa iluminar qualquer região do genoma em qualquer célula viva e permitir que os cientistas observem como diferentes regiões interagem entre si. A ferramenta, relatado em Célula Em 15 de abril, poderia ajudar os cientistas a entender como certos genes são ativados em células saudáveis e em doenças como o câncer.
Anteriormente, os pesquisadores só podiam ver instantâneos de interações de DNA em diferentes pontos de tempo em células preservadas. Assim como a diferença entre uma fotografia e um vídeo, sua tecnologia revela uma quarta dimensão – tempo – nas células que estão vivas e mudando dinamicamente.
“Nosso trabalho transforma o Instagram no YouTube”, disse Qi. “Dá uma compreensão direta do que está acontecendo ao longo do tempo nas células”.
De particular interesse são regiões de DNA que não contêm genes. Apenas cerca de 2% das 3 bilhões de unidades em nosso DNA se converteram em proteínas, um processo conhecido como expressão gênica. Os cientistas costumavam se referir aos outros 98% como DNA lixo, pois não parecia ter um objetivo claro. Agora sabemos que essas regiões de DNA misteriosas contêm características importantes que controlam a expressão do gene.
“Eles são como o software que controla o programa de DNA”, disse Qi.
Esses filmes detalhados de peças de genoma anteriormente esquecidas poderiam oferecer novas idéias fundamentais sobre a biologia. Além disso, ver como o “software” muda em tempo real em células saudáveis em comparação com as doentes pode fornecer pistas sobre a expressão de genes com defeito relacionada à doença.
Correios fluorescentes
O primeiro passo para fazer essa ferramenta foi descobrir como observar uma região específica do genoma dentro da abundante complexidade da bola de fios de DNA. Para isso, os pesquisadores se voltaram para uma versão da tecnologia de edição de genes chamada CRISPR. Esta versão do CRISPR usa uma proteína projetada chamada DCAS9, juntamente com uma molécula de RNA que atua como um endereço de correspondência para um site específico no genoma. Isso permite que o complexo DCAS9-RNA age como um carteiro, encontrando-se e se apegando a um endereço de DNA desejado-enquanto carrega uma molécula de corante fluorescente que é visível como luz sob o microscópio.
Os pesquisadores tornaram seu sinal fluorescente mais brilhante, enviando um bando de correio molecular para abranger endereços de DNA exclusivos dentro do mesmo código postal genético, iluminando a “rua” do DNA de qualquer gene que eles queriam estudar. Sob um microscópio de luz tradicional, essa atividade pareceria uma bolha embaçada porque os movimentos do DNA estão na ordem de dezenas de nanômetros – 5.000 vezes menores que a largura de um cabelo humano e bem abaixo do que um microscópio de luz tradicional pode resolver. Para superar essa limitação, o Laboratório de Qi voltou -se para a experiência de Moerner e sua equipe, que ajudou a pioneira técnicas para detectar a luz emitida de moléculas fluorescentes únicas, um feito que ganhava Moerner the the the Prêmio Nobel em Química em 2014.
As técnicas de microscopia de super-resolução para detectar luz de moléculas únicas agora são amplamente utilizadas, mas uma limitação de muitos microscópios é a incapacidade de coletar informações sobre como uma molécula se move nas três dimensões ao mesmo tempo. Os cientistas podem assistir a um pedaço de DNA tremendo para a esquerda e para a direita, mas o movimento para cima e para baixo só seria capturado em instantâneos que perdem grandes pedaços de tempo. Para preencher as lacunas, Moerner e Team usam um truque óptico em seu microscópio para extrair informações de posição simultânea sobre o DNA nas três dimensões de uma só vez. Assim como um prisma pode dividir a luz visível em seus componentes para produzir um arco -íris, passando a luz através de outros materiais faz com que ela mude de forma de maneiras diferentes.
“Na verdade, existem muitas coisas incríveis que podem ser feitas com a luz. O que fizemos foi adicionar um componente óptico especial que redireciona um ponto de luz em dois pontos, para que as informações de profundidade sejam codificadas no ângulo entre os dois pontos”, explicou Moerner.
Obviamente, esses pontos são os carteiros fluorescentes que a equipe anexou ao DNA. E o ângulo é a peça crítica de informações espaciais que permitiu aos pesquisadores capturar a imagem completa da arquitetura de DNA em tempo real.
Observando as interações em nanoescala 3D entre dois locais no DNA – o intensificador e as regiões promotoras de um gene chamado Fos – durante a expressão gênica. | Ashwin Balaji
Visualizando o movimento do DNA durante a transcrição
A equipe colocou seus carteiros moleculares à prova, fazendo com que eles sigam o “software” – anteriormente parte do DNA “lixo” – que controla o processo de copiar genes antes de se transformarem em proteínas, chamadas de transcrição. Eles descobriram que essas regiões regulatórias de DNA se aproximavam e balançavam menos durante a transcrição, como se estivessem conversando. Que idioma o DNA está falando, o que outras moléculas podem estar envolvidas e se isso acontece com todos os genes ou apenas alguns, estão os tópicos prontos para estudos futuros.
“A transcrição em si é fundamental para a biologia, e temos essa visão em nanoescala de uma maneira que muitos não têm a chance de ver”, disse o autor do estudo Ashwin Balaji, um estudante de graduação no Moerner Lab.
Como sua ferramenta pode ser entregue em qualquer célula viva, eles podem usá -la para imaginar os genomas das células primárias – células isoladas diretamente dos tecidos que ajudam os cientistas a entender o que acontece no corpo.
“Quando podemos ver diferentes locais de DNA em células primárias, como neurônios e células imunes, isso me deixa muito animado porque nunca foi visto antes”, disse o primeiro autor Yanyu Zhu, estudioso de pós -doutorado no Laboratório de Qi.
No futuro, a tecnologia também poderia ser usada para estudar células diretamente de pacientes, como biópsias tumorais, e poderia ser particularmente valiosa para entender como as regiões regulatórias de DNA que não codificam genes contribuem para a doença.
“Estamos tentando aprender o segredo por trás do DNA de 98% ‘lixo’”, disse Qi. “Ninguém mais chama de lixo porque sabemos que é muito importante, mas ainda não temos muita informação sobre o que faz e, o mais importante, como ela desempenha um papel na doença”.
A equipe de Stanford trabalhou para tornar sua tecnologia acessível a outros pesquisadores, tornando seus algoritmos de design e análise disponível gratuitamente. O desenvolvimento dessas ferramentas também foi auxiliado por um terceiro laboratório em Stanford liderado por Andrew SpakowitzProfessor de Engenharia Química e Ciência dos Materiais, tornando este um esforço verdadeiramente interdisciplinar.
“Acho que esse tipo de colaboração é muito poderoso, porque você pode ir além do grupo sozinho”, disse Moerner. “As pessoas trazem habilidades diferentes para a mesa, o que a torna muito estimulante, muito emocionante.”
Para mais informações
Qi também é membro de Bio-xo Instituto Cardiovascularo Instituto de Pesquisa em Saúde Materna e Infantil (MCHRI)o Stanford Cancer Instituteo Instituto de Neurociências de Wu Tsaie é um Chan Zuckerberg Biohub – investigador de São Francisco. Moerner também é professor, por cortesia, da Applied Physics, um membro do corpo docente de Chem-H Saravane um membro de Bio-x e do Instituto de Neurociências de Wu Tsai. Spakowitz também é professor, por cortesia, de física e química aplicada e membro de Bio-x e o Instituto de Engenharia Computacional e Matemática. Outros co-autores de Stanford incluem o estudioso de pós-doutorado Yanyu Zhu, o aluno de doutorado Ashwin Balaji, estudioso de pós-doutorado Menging Han, estudioso de pós-doutorado Leonid Andronov, ex-estudante de PhD Anish Roy, Phd Student Crystal Chen, PostDoctoral Scholarn Miles, Phd Student Student SA CAI, Scholar Takeshi Uenaka.
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health, pela National Science Foundation, pela Stanford School of Medicine, Bio-X e pela V Fundação.
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